domingo, 25 de noviembre de 2012

Biofilm




Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo. El crecimiento en biofilms representa la forma habitual de crecimiento de los microorganismos en la naturaleza. El ejemplo típico de biofilm lo constituye la placa dental, día a día nos esforzamos por combatir la película de bacterias que recubre la superficie de los dientes para evitar un desarrollo excesivo de microorganismos que puede provocar un deterioro del esmalte dental. La capacidad de formación de biofilm no parece estar restringida a ningún grupo específico de microorganismos y hoy se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos, o la gran mayoría de los microorganismos son capaces de formar biofilm.



Diagrama de la formación de la biopelícula en el conducto radicular. a) Conducto vacío, b) Invasión de los microorganismos al interior del conducto radicular, c) Vehículo fluido en el SCR proveniente de la región apical, d) Formación de biopelículas en las paredes del conducto principal y en zonas alejadas del mismo


Lesión (mancha blanca) y carie cavitada

Aunque la composición del biofilm es variable en función del sistema en estudio, en general, el componente mayoritario del biofilm es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por exopolisacáridos. En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, DNA y productos diversos procedentes de la lisis celular. En los primeros trabajos sobre la estructura del biofilm, una de las cuestiones que surgía con mayor reiteración era cómo las bacterias del interior del biofilm podían tener acceso a los nutrientes o al oxígeno. Estudios realizados utilizando microscopía confocal han mostrado que la arquitectura de la matriz del biofilm no es sólida y presenta canales que permiten el flujo de agua, nutrientes y oxígeno incluso hasta las zonas más profundas del biofilm. La existencia de estos canales no evita sin embargo, que dentro del biofilm podamos encontrarnos con ambientes diferentes en los que la concentración de nutrientes, pH u oxígeno es diferente. Esta circunstancia aumenta la heterogeneidad sobre el estado fisiológico en el que se encuentra la bacteria dentro del biofilm y dificulta su estudio.
Etapas en el proceso de la formación de biofilm. La etapa inicial del proceso de formación del biofilm es la adherencia a la superficie. En bacterias Gram negativas (como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enterica) se ha visto que los flagelos y fimbria son importantes para la etapa de adherencia primaria. La motilidad parece ser que ayuda a la bacteria a alcanzar la superficie y contrarrestar las repulsiones hidrofóbicas. Sin embargo, aunque la motilidad ayuda al proceso no parece ser un requisito esencial, muchas bacterias Gram positivas inmóviles como estafilococos, estreptococos y micobacterias son capaces de formar biofilm. En el caso de las bacterias Gram positivas se ha descrito la participación de algunas proteínas de superficie en esta primera etapa de adherencia primaria. Una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie, comienza a dividirse y las células hijas se extienden alrededor del sitio de unión, formando una microcolonia similar a como ocurre durante el proceso de formación de colonias en placas de agar. En una etapa posterior el microorganismo comienza a secretar un exopolisacárido que constituye la matriz del biofilm y forma unas estructuras similares a setas (mushrooms) entre las cuales se observa la presencia de canales. La composición del exopolisacárido es diferente en cada bacteria y varía desde alginato en P. aeruginosa, celulosa en S. typhimurium, un exopolisacárido rico en glucosa y galactosa en V. cholerae, poly-N-acetilglucosamina en S. aureus, etc. Además, estudios recientes han puesto de manifiesto que incluso una misma bacteria, dependiendo de las condiciones ambientales en las que se encuentre, puede producir distintos exopolisacáridos como componentes de la matriz del biofilm. Así, algunas cepas de P. aeruginosa son capaces de producir además de alginato un polisacárido rico en glucosa que forma una película en la interface medio aire al que se ha denominado Pellican.


Biofilm e infección
Aunque normalmente se asocian los biofilms bacterianos con procesos infecciosos, es necesario señalar que algunos biofilms tienen un papel protector. Así, los biofilms de lactobacilos presentes en la vagina fermentan el glucógeno producido por las células epiteliales al ser inducidas por los estrógenos, produciendo ácidos que disminuyen el pH vaginal y previenen de esa manera la colonización por microorganismos patógenos. La desaparición de este biofilm con la consiguiente neutralización del pH suele venir acompañada del desarrollo de microorganismos patógenos como Gardnerella vaginalis y otros microorganismos anaerobios. Otro ejemplo de biofilms beneficiosos lo constituyen los biofilms formados sobre la superficie de los dientes, que protegen frente a la colonización por otros patógenos exógenos. Este biofilm suele estar compuesto en una persona por 20-30 especies bacterianas distintas, entre las que invariablemente destacan en número los estreptococos y Actinomyces sp. Las bacterias de la placa dental viven en equilibrio mientras las condiciones externas se mantengan constantes. Una persona que consuma muchos alimentos o bebidas ricas en azúcares, favorecerá el desarrollo de especies bacterianas que fermentan los azúcares, desequilibrando la población bacteriana y favoreciendo el desarrollo de especies como Streptococcus mutans y Lactobacillus sp., que producen ácidos que disuelven el esmalte protector de los dientes. La consecuencia final es el desarrollo de las dos infecciones más prevalentes en el hombre, la caries y la periodontitis. Junto al papel beneficioso de los biofilms bacterianos, existen numerosas evidencias epidemiológicas que relacionan los biofilms con distintos procesos infecciosos. La infección asociada a tejido dañado-cuerpo-extraño-biomaterial incluye una serie de características comunes: 1. Colonización de sustratos por bacterias adhesivas formadoras de biofilm. 2. Presencia de un biomaterial, tejido dañado, o sustrato de tejido relativamente acelular. 3. Iniciación de infección por pequeños inóculos bacterianos. 4. Resistencia mediada por el biofilm bacteriano a los mecanismos de defensa del huésped y a la terapia antibiótica. 5. Infecciones causadas con mucha frecuencia por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Pseudomonas aeruginosa. 6. Infecciones persistentes por resistencia al tratamiento antimicrobiano. 7. Presencia de inflamación, tejido celular dañado, y necrosis en la interface tejido-implante generado por partículas del biomaterial. 8. Alteración de la respuesta mediada por células y posiblemente humoral del huésped por la presencia del biomaterial y bacterias27 Algunos ejemplos de infecciones relacionadas con biofilm bacteriano son: Endocarditis de válvulas nativas Resulta de la interacción de bacterias u hongos con las válvulas mitral, aorta, tricúspide o pulmonar. Los organismos responsables, principalmente estreptococos y estafilococos que alcanzan el torrente sanguíneo desde la orofaringe, el tracto gastrointestinal o el tracto genitourinario. Estas bacterias normalmente no se adhieren sobre las válvulas intactas, pero si se produce alguna lesión sobre las mismas, las células endoteliales secretan fibronectina, que es utilizada como receptor por adhesinas específicas de la superficie de las bacterias. Las bacterias se multiplican en la lesión y forman el biofilm, lo cual acentúa el daño y puede provocar embolias sépticas. Una vez que el biofilm se ha establecido, los tratamientos antibióticos resultan poco efectivos Otitis media Es una infección que afecta al oído medio, muy frecuente en niños, que puede cursar de forma aguda o crónica y que es causada por un grupo variable de microorganismos, incluyendo, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Una forma de aliviar la presión sobre la membrana timpánica y aumentar la aireación es la colocación de unos tubos timpanostómicos. Estos tubos atraviesan el tímpano y sobre su superficie se adhieren bacterias formando biofilms. Biofilms sobre implantes médicos Los biofilms sobre implantes médicos pueden estar compuestos por bacterias Gram positivas, Gram negativas o levaduras. Estos microorganismos proceden de la piel del propio paciente, del personal sanitario o del ambiente. Pueden estar formados por una única especie o por múltiples especies, dependiendo del implante y de la duración de su uso en el paciente. Cuando un implante se contamina con bacterias varios factores influyen en que se desarrolle un biofilm sobre el mismo. Inicialmente los microorganismos deben adherirse a la superficie del implante el tiempo suficiente para que la adherencia sea irreversible. Esta adherencia depende del flujo de líquido al que está sometido el implante, del número de bacterias que se adhieren y de las características físico-químicas del implante. En el caso de catéteres venosos centrales, la superficie del catéter acaba recubierta de proteínas del plasma, y otras proteínas de los tejidos como fibronectina, fibrinógeno, etc. Estas proteínas favorecen la unión de las bacterias que posean adhesinas para las mismas. En el caso de sondas urinarias, la fuente de contaminación puede ascender desde la bolsa recolectora, entrar en el lumen del catéter a través del exudado en el punto de entrada del catéter. En este caso las bacterias se unen directamente al material del catéter sin que intervengan proteínas del paciente. Una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie del implante y ha formado el biofilm, este biofilm actúa como una fuente de infección sobre todo en pacientes inmunocomprometidos. Los mecanismos por los que el biofilm produce los síntomas de la enfermedad todavía no están completamente establecidos, pero se ha sugerido que las bacterias del biofilm pueden producir endotoxinas, se pueden liberar grupos de bacterias al torrente sanguíneo, se vuelven resistentes a la acción fagocitaria de las células del sistema inmune y por otro lado, constituyen un nicho para la aparición de bacterias resistentes a los tratamientos antibióticos. Este último aspecto puede ser especialmente relevante dado que las bacterias resistentes originadas en un biofilm podrían extenderse de paciente a paciente a través de las manos del personal sanitario. Biofilm y resistencia a antibióticos La característica que mejor distingue las infecciones crónicas relacionadas con biofilms de las infecciones agudas es su respuesta a tratamientos antibióticos. Mientras que las infecciones agudas pueden ser eliminadas tras un breve tratamiento antibiótico, las infecciones por biofilms normalmente no consiguen ser completamente eliminadas, producen episodios recurrentes y la mayoría de las veces deben resolverse sustituyendo el implante. Esto se debe a que las bacterias del biofilm pueden ser hasta 1.000 veces más resistentes a los antibióticos que esas mismas bacterias crecidas en medio líquido. Estrategias de intervención frente a infecciones por biofilms sobre implantes Los microorganismos pueden colonizar la prótesis en el momento de su colocación, por inoculación directa durante la manipulación del tejido o el implante o por contaminación aérea de la herida; y después del implante, por diseminación hematógena, durante una bacteriemia o por extensión directa, a partir de un foco adyacente de infección. La contaminación del implante en el momento de la intervención quirúrgica se puede evitar mediante quimioprofilaxis quirúrgica y/o la utilización de quirófanos dotados de flujo laminar. La posible contaminación posterior se puede evitar mediante el diagnóstico y tratamiento precoz de las infecciones y mediante el uso de quimioprofilaxis en intervenciones y procedimientos médicos que pueden llevar a bacteriemia como extracciones dentarias,
sondaje, etc. El tratamiento antibiótico sistémico en general no consigue la erradicación del biofilm pero en general se debe implantar para destruir las bacterias que pasan al torrente circulatorio. El tratamiento antibiótico sistémico debe ser inicialmente de amplio espectro y debe ser sustituido por antibióticos específicos cuando el laboratorio de microbiología informe la identificación y la susceptibilidad del microorganismo causante de la infección. Dado que un número muy elevado de infecciones asociadas a implantes están causadas por bacterias Gram positivas del género estafilococo, vancomicina y teicoplanina son los antibióticos de primera elección para el tratamiento de estas infecciones. Sin embargo, muy pocas infecciones asociadas a implante resuelven satisfactoriamente, y la recurrencia es muy común. Dado que el tratamiento antibiótico sistémico resulta ineficaz, se han utilizado distintas estrategias para el control y tratamiento de las infecciones asociadas a implantes. Como ejemplo hemos escogido los dos tipos de infecciones más frecuentes la infección asociada a catéteres intravasculares y la infección de prótesis articulares. Tratamiento de infección asociada a catéteres intravasculares La retirada del catéter es el tratamiento más efectivo; sin embargo, en el caso de los catéteres intravasculares tunelizados centrales la retirada puede resultar problemática y el riesgo quirúrgico que supone la retirada puede ser mayor que el riesgo asociado a un tratamiento antibiótico ineficaz. En estos casos se recomienda un tratamiento denominado de sellado antibiótico, que consiste en instilar en el interior del catéter una solución de anticoagulante (heparina o EDTA) y antibiótico a una concentración entre 100 y 1.000 veces mayor que la concentración mínima inhibitoria del microorganismo responsable de la infección asociada a catéter, durante al menos 8 horas diarias a lo largo de 10-14 días33. Los antibióticos que mejores resultados están ofreciendo en este tipo de tratamiento son gentamicina, levofloxacina, cotrimoxazol, minociclina, teicoplanina y vancomicina. El uso de catéteres impregnados con antimicrobianos o antiinfecciosos ha sido otra estrategia aunque su eficiencia está en discusión. Los antibióticos/antiinfecciosos más utilizados para impregnar los catéteres son cefazolina, Chlorhex-sulfadiazina de plata, minociclina-rifampicina, impregnación de plata-iontoforesis. Tratamiento de infecciones sobre prótesis articulares El tratamiento de las infecciones de prótesis articulares incluye terapia antimicrobiana agresiva junto con procedimientos quirúrgicos que incluye desbridamiento completo para retirar todos los materiales infectados incluyendo el segmento y los tejidos desvitalizados y el hueso. En la mayor parte de los casos los intentos para salvar la prótesis son infructuosos y es necesaria la retirada del implante junto con una pauta antimicrobiana apropiada de larga duración y posterior reimplantación de la prótesis articular. Recientemente un consorcio de bioquímicos, microbiólogos, cirujanos e ingenieros de sistemas microelectromecánicos se han unido para desarrollar un implante inteligente que sería capaz de detectar la presencia en la superficie de patógenos bacterianos, bloquear sus sistemas de transducción de señal y tratar la infección incipiente con altas dosis de antibióticos localizados y comunicar los resultados de las acciones tomadas al personal responsable del cuidado del paciente a través de telemetría35. Este es un ejemplo ilustrativo de cómo diferentes disciplinas pueden ofrecer soluciones imaginativas a las infecciones asociadas a implantes en un futuro no muy lejano.
Conclusión.
 Las bacterias han crecido en biofilms durante millones de años, como parte de una estrategia exitosa para colonizar el planeta y la mayoría de los seres vivos. La formación de biofilms representa un problema para aquellos pacientes que requieran un implante o utilización de prótesis removibles o no. Los microorganismos del biofilm son muy difíciles de tratar con agentes antimicrobianos ya que se trata de formas de resistencia, y la liberación de bacterias desde el biofilm puede provocar una infección, sobre todo si el paciente esta inmuno comprometido. Es necesario llevar a cabo un estudio profundo de estas estructuras en general y en particular de cada uno de los microorganismos que sean capaces de desarrollarlo, nuevos métodos para detectar la presencia de biofilm como así también diseñar estrategias de control que en combinación con nuevos fármacos antimicrobianos permitan instaurar tratamientos precoces y efectivos para su erradicación y/o tratamiento de la infección producida por biofilm Todos los esfuerzos dirigidos a la identificación de genes que sean necesarios para la formación del biofilm, la búsqueda de enzimas capaces de degradar específicamente la matriz polisacarídica del biofilm, métodos físicos como ultrasonidos que perturben la estabilidad de la matriz o los estudios dirigidos a descifrar los patrones de expresión génica entre las bacterias planctónicas y las bacterias del biofilm deben ser considerados como fuente de posibles estrategias que nos ayudarán a comprender y combatir mejor las infecciones producidas por biofilms bacteriano

Bibliografía.
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 Branda, S. S., Vik, A., Friedman, L. & Kolter, R. (2005) Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13: 20-26.
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 O’Toole, G., Kaplan, H. B. & Kolter, R. (2000) Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54: 49-79.

domingo, 21 de octubre de 2012

ADHESION BACTERIANA A CELULAS DEL SISTEMA RESPIRATORIO


ADHESION  BACTERIANA  A CELULAS DEL  SISTEMA  RESPIRATORIO

La adhesión bacteriana es el término que indica la capacidad de las bacterias para adherirse a los distintos tipos de superficies que existen en el ambiente.
Cuando estas superficies son las que se encuentran en el ser humano se produce una situación potencialmente peligrosa, si la bacteria se fija con éxito en la “mucosa”, coloniza produciendo infección. Recordemos que el proceso infeccioso o infección, esta dado por estos tres pasos: invasión (entrada del microorganismo al hospedador), colonización (alojamiento del microorganismo en una célula o tejido del hospedador) y multiplicación (aumento del número de células microbianas dentro del hospedador).
Un ejemplo válido de interacción entre las células bacterianas y el ser humano se ve durante la respiración.
Cuando una persona inspira puede inhalar cerca de 10 mil microorganismos por cada 24 horas, se considera que una persona inhala unos 15 mil litros de aire ambiental en reposo y más de 20 mil litros en función de una actividad por cada 24 horas.
Para ser capaz de afrontar tal agresión, la superficie mucosa presenta varios mecanismos de defensa para prevenir la colonización bacteriana, tales como:
  • Secreción de moco
  • Clearance  mucociliar
  • Defensas celulares
  • Defensas inmunológicas

MOCO BRONQUIAL E INTERACCIONES BACTERIANAS
.
La adhesión bacteriana y su relación con la vía respiratoria humana es un fenómeno particularmente complejo; aunque la descripción de las interacciones recíprocas sea amplia, es necesario brindar previamente cierta información básica sobre las características del moco, de los cilios, del clearance mucociliar y de los mecanismos físico-químicos que median tal adhesión.

Características del moco bronquial.

Origen: es el producto final de las distintas células de secreción presentes en la vía respiratoria. Las principales células involucradas son: células calciformes, células serosas epiteliales, células secretoras de la submucosa y células ciliadas.

Función: el moco constituye una barrera de defensa móvil protectora para la superficie  de respiración, esta función incluye: humidificación del aire respirado, aislamiento de la polución ambiental, protección antimicrobiana/antiviral, ambiente adecuado para la acción ciliar e impermeabilización de las vías respiratorias. Entre las funciones de barrera, se encuentran: captura de microorganismos, disolución de gases tóxicos, tamiz macromolecular selectivo, superficie extracelular para la acción de las inmunoglobulinas y superficie extracelular para la acción de enzimas. Y función de transporte, como lámina de revestimiento para la eliminación de materiales atrapados junto a los cilios.

Composición: los componentes del moco son: 95% agua, 4% macromoléculas como glicoproteínas, lípidos y proteínas y 1% de iones como Na, K, P, Cl y Ca.

Estructura: el moco traqueo bronquial normalmente asume el aspecto físico de un gel, esta estructura se debe a la mezcla de agua con algunas proteínas concretas en el moco, llamadas mucoglicoproteínas o mucinas, también se pueden observar que esta mezcla posee dos características físicas importantes: la viscosidad y elasticidad.

Afinidad bacteriana con el moco bronquial.

El primer impacto de las bacterias inhaladas con la mucosa respiratoria, es generalmente con el moco. Las mucinas  son las principales moléculas presentes en el moco respiratorio y están compuestas por un 70% - 80% de carbohidratos. Estos carbohidratos son los principales receptores para la adhesión bacteriana, esto significa que la mucosa respiratoria es rica en receptores potenciales de bacterias. Los patógenos respiratorios, Streptococcus pneumonieae, Haemophylus influenzae y Staphylococcus aureus  comúnmente se unen al moco respiratorio.

CILIOS, CLEARANCE MUCILIAR E INTERACCIONES BACTERIANAS.

Cilios: identifica un tipo particular de estructura parecida a un cabello que sobresale de las superficies libres de las células. Tal estructura fue descrita inicialmente en 1684 por Anton de Heide10-11.
Los cilios hallados en casi todas las phyla del reino animal desarrollan algunas funciones vitales tales  como el movimiento, la alimentación, la digestión, la excreción, la reproducción, la respiración y la limpieza de superficies, etc.  Debido al importante papel que los cilios juegan en la fisiología del tracto respiratorio, no es sorprendente que en la tráquea y en los bronquios primarios, el tipo de célula predominante sea la epitelial ciliada-

Clearance mucociliar: el transporte de moco consecuente al movimiento coordinado de lso cilios se llama “clearance mucociliar”, el comportamiento depende del control fisiológico de las células ciliadas y de la regulación de las propiedades como visco elasticidad de la capa mucosa.

Interacción bacteriana con los cilios  clearance mucociliar: algunas bacterias producen factores que pueden perturbar el sistema mucociliar reduciendo y desorganizando los movimientos ciliares.
Algunos de estos factores inhibidores ciliares han sido caracterizados, por ejemplo: P. aeruginosa produce piocianina, entre otros; H. influenzae produce glicopéptidos de bajo peso molecular y S. pneumoniae produce pneumolisina.
Experimentos in vitro han demostrado una secuencia de severidad progresiva en la interacción bacteriana con los cilios, en relación con algunos parámetros tales como: tiempo de contacto, cantidad de toxinas bacterianas, desorientación ciliar en la coordinación del movimiento y rotura integran epitelial. El clearance mucociliar también puede verse afectado por modificaciones en la profundidad y composición del fluido de lavado y por la bioquímica de las secreciones, estos dos últimos factores pueden verse alterados por toxinas bacterianas1.

ADHESION BACTERIANA COMO FACTOR DE VIRULENCIA.

Así como la presencia de bacterias en la vía respiratoria lesiona el epitelio, también lo hacen los productos tóxicos de las distintas especies bacterianas, causando la muerte de las células ciliadas y calciformes. Esta ruptura es favorable para las bacterias las cuales pueden adherirse a nuevos receptores expuestos por esta situación12-14. Además de las lesiones del epitelio respiratorio causan una alteración en lso mecanismos de defensa tales como el movimiento ciliar y/o el clearance mucociliar con el consiguiente fenómeno de “mucostasis”, estas situaciones unidas a la sobreproducción reactiva de moco contribuye en la infección bacteriana.
El uso de antibióticos es adoptado comúnmente para contrarrestar la infección una vez que se ha producido, pero está claro que la prevención de la adhesión  bacteriana en la vía respiratoria representa el mejor enfoque del problema.




MECANISMOS DE ADHESION BACTERIANA.

Adsorción.

Este término indica una interacción débil y reversible entre la superficie de las bacterias y la superficie de las células.

Adhesión.

Forma de unión cerrada, estable e irreversible de las bacterias con una superficie. La adhesión bacteriana ocurre cuando moléculas especializadas que se encuentran en la superficie de las bacterias interaccionan o se combinan con otras moléculas presentes en las células mucosas del epitelio.

Agregación.

Es un proceso por el que las células bacterianas se reúnen en estrecho contacto, como en la formación de una microcolonia.

Invasión.

Invasión es la forma más íntima  de interacción muco – bacteriana, en la que las bacterias patógenas penetran la barrera mucosa y entran en las células.





MECANISMOS INTERVINIENTES EN LA ADHESION.

La superficie bacteriana es estructural y químicamente compleja en extremo, sus componentes incluye polímeros de largas cadenas (polisacáridos extracelulares) o apéndices  filamentosos (fimbrias y flagelos) los cuales se extienden en el medio circundante a distancias de nanómetros a micrómetros.
Cuando una bacteria, conducida por al aire inhalado, impacta sobre la capa fluida que recubre la superficie de la vía aérea, se introduce en un microambiente químico compuesto de agua, distintos tipos iones y macromoléculas.

Fuerzas de atracción y repulsión.

  Cuando la distancia entre la bacteria y la célula de la mucosa disminuye (10 – 20 nm) se produce una repulsión electrostática que puede evitar la aproximación y por lo tanto impedir la adhesión15. A pasar de esto la adhesión bacteriana es un hallazgo común en experimentos e investigaciones clínicas, pero entonces cómo sobrepasan las bacterias la zona de repulsión intermedia? Una posible explicación procede de la observación de que la superficie de las bacterias no es lisa sino que posee una variedad de estructuras que la ayudan a adherirse a la superficie, estas estructuras pueden actuar como puente ayudando  a las bacterias a superar las fuerzas de repulsión


 Adhesión irreversible

En el momento en que  la distancia de separación es menor a 1 nm, el paso final de adhesión entra en juego; la producción de enlaces químicos directos entre moléculas bacterianas específicas, llamadas “adhesinas” y moléculas complementarias de células epiteliales, llamadas “receptoras”, conducen a una adhesión irreversible

ADHESINAS Y RECEPTORES.

Adhesina es el término que define a cualquier molécula de la superficie bacteriana que media la adhesión a un receptor ubicado sobre un sustrato
Químicamente las adhesinas pueden ser: proteínas, polisacáridos, ácidos teicoico o lípidos, están expuestas sobre la superficie de las bacterias, pudiendo ubicarse sobre las fimbrias, fibrillas, pared celular o membrana exterior.
Receptores: cualquier molécula superficial de un sustrato y en particular de una célula huésped, complementaria de una adhesina bacteriana, se llama receptor.
Químicamente, estos receptores consisten en proteínas, glicoproteínas o glicolípidos. En algunos casos, un receptor puede tener dos sitios de unión distintos para dos tipos diferentes de adhesinas.

INTERFERENCIA EN LA ADHESION BACTERIANA

Estrategia: inhibidores metabólicos; beneficio: bajas dosis de antibióticos eliminan la toxicidad y el costo adicional, los antibióticos pueden impedir la manifestación de múltiples adhesinas; problemas: las cepas son resistentes a dosis letales, también lo son a dosis subletales.

Estrategia: lectinas dietarias; beneficio: dieta normal para muchas personas, un solo producto de la dieta puede contener inhibidores de varias adhesinas; problemas: es difícil estandarizar las concentraciones.

Estrategia: inmunización activa o pasiva con adhesinas; beneficio: protección duradera; problemas: heterogeneidad antigénica, adhesinas múltiples.

Antibióticos.

Los signos clínicos de una infección bacteriana son el resultado de un proceso en etapas el cual empieza con la adhesión de lso microorganismos a una superficie mucosa del cuerpo seguida por la reproducción y formación de una colonia, la cual emite toxinas y provoca señales de infección.
En estos casos se puede aplicar una terapia antibiótica asumiendo que estos fármacos alcanzan una concentración en el lugar de la infección capaz de eliminar la virulencia de los microorganismos.

CONCLUSIÓN.

El propósito de investigar los mecanismos involucrados en la unión de bacterias patógenas a las superficies mucosas, es comprender este importante factor de virulencia a fin de desarrollar estrategias que interfieran sobre el estadio inicial, antes de que los microorganismos tengan la oportunidad de producir daño tisular.
Si bien este es el objetivo ideal, la elevada frecuencia de las infecciones bacterianas deja en claro que alcanzarlo no es una tarea fácil y por ahora, la vía de tratamiento rutinaria es el uso de antibióticos.

FUENTE
Pier Carlo Braga

domingo, 19 de agosto de 2012

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD FOSFOLIPASA Y PRODUCCIÓN DE BIOFILM COMO FACTORES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE LEVADURAS PROVENIENTES DE MUESTRAS CLÍNICAS

Puigdomenech, G; Bulacio, L. García M. –  Salcedo S. (revisión)
 Laboratorio de Microbiología – Instituto Superior La Salle – Rosario - Argentina
germanpuigdomenech@hotmail.com


Resumen    
La incidencia de infecciones causadas por especies de Candida se ha incrementado en los últimos años. Entre los factores que confieren más virulencia a estos organismos, las enzimas hidrolíticas como fosfolipasas y proteasas juegan un papel importante, ya que actúan en la invasión de los tejidos. Otro factor importante a considerar es la capacidad de formar biopelículas.
Palabras clave: biofilm, candidiasis, fosfolipasas, virulencia

Abstract
     The incidence of infections caused by Candida species has increased in recent years. Among the more virulence factors that confer to these organisms, hydrolytic enzymes such as phospholipases and proteases play an important role, since they act in the invasion of tissues. Another important factor to consider is the ability to form biofilms.
Introducción
     Candida sp. son organismos comensales de mucosa oral, intestino, etc. de individuos sanos. La colonización de este microorganismo, especialmente Candida albicans puede llevar a la infección sistémica cuando el huésped tiene factores de riesgo como uso continuo de antibióticos de amplio espectro, esteroides u otros agentes inmunosupresores, diabetes mellitus, SIDA, depresión de las funciones fagocíticas o alteraciones locales del sistema gastrointestinal, situaciones que pueden ocasionar candidiasis y hasta diseminación hematógena 1.
     Tanto C. albicans como otras especies del género, es un microorganismo versátil por su capacidad de sobrevivir como comensal en varios sitios anatómicamente distintos (intestino, cavidad oral, vagina) siendo oportunista ante la mínima posibilidad. La limitación de nutrientes, la competencia entre bacterias y hongos de la microbiota en la superficie de mucosas proporcionan una presión selectiva que ocasiona la eliminación de aquellos microorganismos menos adaptados.
     Candida tiene atributos de virulencia para colonizar el huésped ocasionando daño de forma directa, al activar, resistir o desviar mecanismos de defensa del hospedero. Los factores de virulencia expresados por el microorganismo para causar infección varían según el tipo, sitio y naturaleza de las defensas del huésped2.
     El frágil equilibrio entre el huésped y el hongo patógeno deriva en una relación parásita y resulta en enfermedad, a veces, grave. La interacción entre el hongo y el medio ambiente está afectada por su variabilidad antigénica, el cambio fenotípico y la transición dimórfica. Existen diversos factores potenciales de virulencia como la morfología celular, actividad enzimática extracelular, cambio fenotípico y factores de adherencia (formación de biopelículas).
     C. albicans es polimórfica que existe en forma de levadura (blastospora) o como filamentos (pseudohifa), la morfogénesis se refiere a la transición entre la forma levaduriformes y la forma de crecimiento filamentosa del microorganismo. Esta conversión es esencial en cuanto a la virulencia de C. albicans y otras especies, atributo que capacita al microorganismo para invadir tejidos. Se ha comprobado que el crecimiento de la forma filamentosa tiene ventajas sobre la levadura en la penetración de la célula o tejido, y aunque la hifa puede ser  idónea para atravesar barreras tisulares, la secreción de enzimas capaces e degradar proteínas, lípidos y otros componentes celulares, está facilita su infiltración en sustratos sólidos y tejidos3.
    En general, las levaduras predominan durante la colonización de la mucosa en el huésped sano pero la hifa emerge cuando las defensas de éste declinan, por lo tanto, ambas formas de crecimiento podrían desempeñar un papel importante en la patogénesis y encontrarse en varios microambientes diferentes en el huésped4.
    Existen hallazgos que sustentan la hipótesis de que la filamentización es uno de los factores de virulencia del hongo: la formación de filamentos a 37°C en suero humano o de conejo a pH neutro, los filamentos recién formados (tubos germinales) son más adherentes a células mamíferas que las levaduras, y la adherencia en el requisito para la penetración celular, y por último, las levaduras capturadas por macrófagos producen filamentos y son capaces de lisar a éstos, por lo tanto la formación de filamentos es una forma de evadir los mecanismos de defensa del huésped5-6.
    En cuanto a las enzimas, se proponen a éstas como determinantes de virulencia en Candida ya que tienen la capacidad de romper polímeros que proporcionan nutrientes accesibles para el crecimiento de l hongo. Las principales enzimas extracelulares relacionadas con la patogénesis en Candida son proteasas, fosfolipasas y lipasas. Se han descrito varios miembros de una familia de enzimas de secreción aspártico proteinasa (SAP) muy estudiadas en este hongo, en particular, las aspartil proteinasas (Saps) codificadas por genes de la familia SAP. Las proteínas que compren esta familia no se limitan sólo a C. albicans sino también  a C. dubliniensis, C. tropicalis y C. parapsilosis.
    Otras enzimas hidrolíticas secretadas son las fosfolipasas, relacionadas con la patología causada por C. albicans. Se ha demostrado cuatro tipos de fosfolipasas (PLA, PLB, PLC y PLD) de las cuales sólo PLB ja demostrado ser necesaria para la virulencia del hongo a fin de llevar a cabo una candidiasis, la que se secreta y detecta en la punta de la hifa durante la invasión en tejidos7.
    Las lipasas secretadas por Candida se codifican por una familia de genes con al menos diez miembros (LIP1-LIP10). El patrón de expresión se ha investigado en infecciónes experimentales y en pacientes con candidiasis oral8.
    En cuanto a la formación de biopelículas (biofilm) las especies de Candida se reconocen como los principales agentes de infecciones adquiridas en el hospital. Son el tercer o cuarto patógeno aislado en sangre, sobrepasa la frecuencia de los bacilos gramnegativos. Los dispositivos como catéteres intravasculares  o urinarios y tubos endotraqueales  como así también los sistemas de respiración mecánica se asocian con infecciones detectándose la formación de biopelículas  en su superficie9. Otros dispositivos como válvulas cardíacas, marcapasos y reemplazos de articulaciones (cadera y rodilla) son susceptibles de infección por Candida.
    La mayor capacidad de C. albicans para formar biopelículas en superficies es la razón por la que esta especie es más patogénica que las que son menos capaces de formar estas estructuras, como es el caso de C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis.
    La formación de biofilm se distingue por adhesión inicial de las células de levaduras seguida por la germinación y formación de microcolonias, filamentización, desarrollo, formación e monocapa, proliferación y maduración: esta formación de biopelículas se lleva a cabo en tres fases, temprana (de 0 a 11 horas), intermedia (de 12 a 30 horas), y por último la fase madura (de 38 a 72 horas). La estructura detallada del biofilm después de las 72 horas de incubación consiste en una densa red de levaduras, hifas y pseudohifa, esta mezcla sumada al material matriz en medio líquido10-11.

Objetivo
     El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de secreción de fosfolipasas y producción de biofilm por parte de levaduras  del género Candida recuperadas de pacientes con candidiasis oral.

Material y método
     Se analizaron 93 cepas provenientes de pacientes: 48 de Candida albicans, 16 de C. parapsilosis, 7 de C. krusei, 5 de C. dubliniensis, y 17 de C. tropicalis, identificadas por métodos de rutina.
    La detección de actividad Fosfolipasa de evaluó mediante el cultivo en placas de Agar Sabouraud y Agar Extracto de Malta suplementados 8% con yema de huevo, cultivo a 37°C durante cinco días. Luego se determinó el índice Pz que es la relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro de la colonia más halo de precipitación.
    La producción de biofilm se evaluó por incubación de cada una de las cepas en caldo Sabouraud 2% a 30°C durante 72 horas, utilizando tubos Eppendorf, seguida de coloración con solución de  cristal violeta y lectura de absorbancia a 530 nm.



                     Fosfolipasa de cepas de Candida en agar Extracto de Malta suplementado con yema de huevo






                                                   Cultivos de levaduras en Caldo Sabouraud 2%                                                    






                                                                               Producción de biofilm


Resultados
     En cuanto a la actividad Fosfolipasa, 35 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 6 de C. krusei, 14 de C. tropicalis y 4 de C. parapsilosis mostraron índice [Pz] menor a 0,69; por otro lado 5 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 2 de C. tropicalis, 1 de C. parapsilosis, arrojaron Pz entre 0,7-0,8, mientras que 5 cepas de C. albicans, 1 cepa de C. dubliniensis y 1 de C. parapsilosis, Pz entre 0,81-0,9. El resto de las cepas no presentaron actividad enzimática (Pz =1).
     Con respecto a la producción de biofilm: resultaron fuertes productoras de biofilm 7 cepas de C. albicans, 6 de C. parapsilosis, 3 de C. krusei y 11 de C. tropicalis, en tanto que fueron productoras débiles 7 cepas de C. albicans, 8 de C. parapsilosis y 3 cepas de C. tropicalis. El resto de las cepas estudiadas no produjeron biopelículas. El punto de corte establecido para la formación de biopelícula fue: lectura de 0-0.12 negativo; de 0.13 a 0.24 producción débil y mayor a 0.24 fuerte productor de biopelícula.

Conclusión
     Tanto la producción de biofilm y la secreción de enzimas hidrolíticas facilitan la adherencia y posterior invasión de los tejidos del hospedero por parte de las levaduras. Es sumamente importante detectar estas características a los efectos de establecer estrategias para evitar la diseminación, instaurando tratamientos efectivos y precoces.

Referencias
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  8. Sther F, Felk A y col. Expresion analysis of Candida sp. lipase gene family. Rev Microbiol Mex 2004;4(4-5):401-8
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