viernes, 24 de agosto de 2012
miércoles, 22 de agosto de 2012
domingo, 19 de agosto de 2012
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD FOSFOLIPASA Y PRODUCCIÓN DE BIOFILM COMO FACTORES DE VIRULENCIA EN CEPAS DE LEVADURAS PROVENIENTES DE MUESTRAS CLÍNICAS
Puigdomenech, G; Bulacio, L. García M. – Salcedo S. (revisión)
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Laboratorio de Microbiología – Instituto Superior La Salle – Rosario - Argentina
germanpuigdomenech@hotmail.com
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Resumen
La incidencia de infecciones causadas por especies de Candida se ha incrementado en los últimos años. Entre los factores que confieren más virulencia a estos organismos, las enzimas hidrolíticas como fosfolipasas y proteasas juegan un papel importante, ya que actúan en la invasión de los tejidos. Otro factor importante a considerar es la capacidad de formar biopelículas.
Palabras clave: biofilm, candidiasis, fosfolipasas, virulencia
Abstract
The incidence of infections caused by Candida species has increased in recent years. Among the more virulence factors that confer to these organisms, hydrolytic enzymes such as phospholipases and proteases play an important role, since they act in the invasion of tissues. Another important factor to consider is the ability to form biofilms.
Introducción
Candida sp. son organismos comensales de mucosa oral, intestino, etc. de individuos sanos. La colonización de este microorganismo, especialmente Candida albicans puede llevar a la infección sistémica cuando el huésped tiene factores de riesgo como uso continuo de antibióticos de amplio espectro, esteroides u otros agentes inmunosupresores, diabetes mellitus, SIDA, depresión de las funciones fagocíticas o alteraciones locales del sistema gastrointestinal, situaciones que pueden ocasionar candidiasis y hasta diseminación hematógena 1.
Tanto C. albicans como otras especies del género, es un microorganismo versátil por su capacidad de sobrevivir como comensal en varios sitios anatómicamente distintos (intestino, cavidad oral, vagina) siendo oportunista ante la mínima posibilidad. La limitación de nutrientes, la competencia entre bacterias y hongos de la microbiota en la superficie de mucosas proporcionan una presión selectiva que ocasiona la eliminación de aquellos microorganismos menos adaptados.
Candida tiene atributos de virulencia para colonizar el huésped ocasionando daño de forma directa, al activar, resistir o desviar mecanismos de defensa del hospedero. Los factores de virulencia expresados por el microorganismo para causar infección varían según el tipo, sitio y naturaleza de las defensas del huésped2.
El frágil equilibrio entre el huésped y el hongo patógeno deriva en una relación parásita y resulta en enfermedad, a veces, grave. La interacción entre el hongo y el medio ambiente está afectada por su variabilidad antigénica, el cambio fenotípico y la transición dimórfica. Existen diversos factores potenciales de virulencia como la morfología celular, actividad enzimática extracelular, cambio fenotípico y factores de adherencia (formación de biopelículas).
C. albicans es polimórfica que existe en forma de levadura (blastospora) o como filamentos (pseudohifa), la morfogénesis se refiere a la transición entre la forma levaduriformes y la forma de crecimiento filamentosa del microorganismo. Esta conversión es esencial en cuanto a la virulencia de C. albicans y otras especies, atributo que capacita al microorganismo para invadir tejidos. Se ha comprobado que el crecimiento de la forma filamentosa tiene ventajas sobre la levadura en la penetración de la célula o tejido, y aunque la hifa puede ser idónea para atravesar barreras tisulares, la secreción de enzimas capaces e degradar proteínas, lípidos y otros componentes celulares, está facilita su infiltración en sustratos sólidos y tejidos3.
En general, las levaduras predominan durante la colonización de la mucosa en el huésped sano pero la hifa emerge cuando las defensas de éste declinan, por lo tanto, ambas formas de crecimiento podrían desempeñar un papel importante en la patogénesis y encontrarse en varios microambientes diferentes en el huésped4.
Existen hallazgos que sustentan la hipótesis de que la filamentización es uno de los factores de virulencia del hongo: la formación de filamentos a 37°C en suero humano o de conejo a pH neutro, los filamentos recién formados (tubos germinales) son más adherentes a células mamíferas que las levaduras, y la adherencia en el requisito para la penetración celular, y por último, las levaduras capturadas por macrófagos producen filamentos y son capaces de lisar a éstos, por lo tanto la formación de filamentos es una forma de evadir los mecanismos de defensa del huésped5-6.
En cuanto a las enzimas, se proponen a éstas como determinantes de virulencia en Candida ya que tienen la capacidad de romper polímeros que proporcionan nutrientes accesibles para el crecimiento de l hongo. Las principales enzimas extracelulares relacionadas con la patogénesis en Candida son proteasas, fosfolipasas y lipasas. Se han descrito varios miembros de una familia de enzimas de secreción aspártico proteinasa (SAP) muy estudiadas en este hongo, en particular, las aspartil proteinasas (Saps) codificadas por genes de la familia SAP. Las proteínas que compren esta familia no se limitan sólo a C. albicans sino también a C. dubliniensis, C. tropicalis y C. parapsilosis.
Otras enzimas hidrolíticas secretadas son las fosfolipasas, relacionadas con la patología causada por C. albicans. Se ha demostrado cuatro tipos de fosfolipasas (PLA, PLB, PLC y PLD) de las cuales sólo PLB ja demostrado ser necesaria para la virulencia del hongo a fin de llevar a cabo una candidiasis, la que se secreta y detecta en la punta de la hifa durante la invasión en tejidos7.
Las lipasas secretadas por Candida se codifican por una familia de genes con al menos diez miembros (LIP1-LIP10). El patrón de expresión se ha investigado en infecciónes experimentales y en pacientes con candidiasis oral8.
En cuanto a la formación de biopelículas (biofilm) las especies de Candida se reconocen como los principales agentes de infecciones adquiridas en el hospital. Son el tercer o cuarto patógeno aislado en sangre, sobrepasa la frecuencia de los bacilos gramnegativos. Los dispositivos como catéteres intravasculares o urinarios y tubos endotraqueales como así también los sistemas de respiración mecánica se asocian con infecciones detectándose la formación de biopelículas en su superficie9. Otros dispositivos como válvulas cardíacas, marcapasos y reemplazos de articulaciones (cadera y rodilla) son susceptibles de infección por Candida.
La mayor capacidad de C. albicans para formar biopelículas en superficies es la razón por la que esta especie es más patogénica que las que son menos capaces de formar estas estructuras, como es el caso de C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis.
La formación de biofilm se distingue por adhesión inicial de las células de levaduras seguida por la germinación y formación de microcolonias, filamentización, desarrollo, formación e monocapa, proliferación y maduración: esta formación de biopelículas se lleva a cabo en tres fases, temprana (de 0 a 11 horas), intermedia (de 12 a 30 horas), y por último la fase madura (de 38 a 72 horas). La estructura detallada del biofilm después de las 72 horas de incubación consiste en una densa red de levaduras, hifas y pseudohifa, esta mezcla sumada al material matriz en medio líquido10-11.
Objetivo
El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de secreción de fosfolipasas y producción de biofilm por parte de levaduras del género Candida recuperadas de pacientes con candidiasis oral.
Material y método
Se analizaron 93 cepas provenientes de pacientes: 48 de Candida albicans, 16 de C. parapsilosis, 7 de C. krusei, 5 de C. dubliniensis, y 17 de C. tropicalis, identificadas por métodos de rutina.
La detección de actividad Fosfolipasa de evaluó mediante el cultivo en placas de Agar Sabouraud y Agar Extracto de Malta suplementados 8% con yema de huevo, cultivo a 37°C durante cinco días. Luego se determinó el índice Pz que es la relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro de la colonia más halo de precipitación.
La producción de biofilm se evaluó por incubación de cada una de las cepas en caldo Sabouraud 2% a 30°C durante 72 horas, utilizando tubos Eppendorf, seguida de coloración con solución de cristal violeta y lectura de absorbancia a 530 nm.
Producción de biofilm
Resultados
En cuanto a la actividad Fosfolipasa, 35 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 6 de C. krusei, 14 de C. tropicalis y 4 de C. parapsilosis mostraron índice [Pz] menor a 0,69; por otro lado 5 cepas de C. albicans, 1 de C. dubliniensis, 2 de C. tropicalis, 1 de C. parapsilosis, arrojaron Pz entre 0,7-0,8, mientras que 5 cepas de C. albicans, 1 cepa de C. dubliniensis y 1 de C. parapsilosis, Pz entre 0,81-0,9. El resto de las cepas no presentaron actividad enzimática (Pz =1).
Con respecto a la producción de biofilm: resultaron fuertes productoras de biofilm 7 cepas de C. albicans, 6 de C. parapsilosis, 3 de C. krusei y 11 de C. tropicalis, en tanto que fueron productoras débiles 7 cepas de C. albicans, 8 de C. parapsilosis y 3 cepas de C. tropicalis. El resto de las cepas estudiadas no produjeron biopelículas. El punto de corte establecido para la formación de biopelícula fue: lectura de 0-0.12 negativo; de 0.13 a 0.24 producción débil y mayor a 0.24 fuerte productor de biopelícula.
Conclusión
Tanto la producción de biofilm y la secreción de enzimas hidrolíticas facilitan la adherencia y posterior invasión de los tejidos del hospedero por parte de las levaduras. Es sumamente importante detectar estas características a los efectos de establecer estrategias para evitar la diseminación, instaurando tratamientos efectivos y precoces.
Referencias
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- Castillón R y col. Reacción inmunológica en infecciones por Candida sp. Rev Mex Dermatología 2004;48(3):140-50
- Hube B, Naglik J. Candida albicans proteinases. Microbiology 2001;147:1997-2005.
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- Allistair J. Fungal morphogenesis and host invasión. Rev Microbiol 2002;5:366-71
- Calderone AR y col. Virulence factors of Candida albicans. Trends Microbiol 2001;9(1):327-35
- Sther F, Felk A y col. Expresion analysis of Candida sp. lipase gene family. Rev Microbiol Mex 2004;4(4-5):401-8
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domingo, 12 de agosto de 2012
miércoles, 1 de agosto de 2012
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